非結核分枝桿菌（NTM）是指除MTB復合群和麻風分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌總稱，是一種環境生長菌，在自然界廣泛存在。目前全世界已發現NTM 190余種，但只有少數是致病菌，屬于條件致病菌，主要侵犯肺部。近年來國內NTM發病率不斷增加，以鳥復合分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌最為常見。隨著分子生物學的發展，不斷有新的菌種被發現、親緣關系密切的菌種被鑒定出來，使得NTM菌種分類更加細化和完善。

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菌種鑒定的目的是對NTM病進行精準診斷，包括對NTM臨床相關性的判定，同時由于不同菌種對藥物的敏感性不同，菌種鑒定對治療方案的制定也具有重要價值。臨床最常見的快速生長分枝桿菌包括膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌和龜分枝桿菌，感染通常選用大環內酯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等藥物治療。最常見的慢生長分枝桿菌包括鳥分枝桿菌復合群(MAC，主要包括鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌)、堪薩斯分枝桿菌及蟾蜍分枝桿菌等，治療通常選取大環內酯類和利福霉素類藥物，有時候加用注射類抗結核藥物。

目前常用商業化菌種鑒定試劑盒對NTM進行菌種鑒定，具有操作相對簡單、在醫療機構可獨立完成且能夠滿足臨床基本需求的優點，但由于納入菌種數量有限，無法完全覆蓋NTM高流行地區實際分離到的菌種類型，容易導致鑒定失敗或錯誤。而全基因組測序技術可以彌補并很好地解決此方面問題，因其具有較高的靈敏度及強大的鑒別能力，尤其是在無法獲得可能感染病原體線索的情況下優勢更為明顯，故臨床應用越來越多。

晶諾生物針對NTM菌種鑒定已經建立完善的實驗和數據分析平臺。NTM分析服務從基因組提取開始，針對分枝桿菌的基因組特征，建立了針對性、標準化的基因組提取和質控評估平臺；基于Illumina測序平臺獲得高通量測序數據，對測序結果進行拼接獲得基因組草圖，通過與NTM參考基因組進行Pairwise基因組核酸相似度（gANI）分析。數據分析中以95%的相似度為閾值進行分枝桿菌物種判定，同時可根據相似度矩陣構建系統發育樹，分析種間及種內群體多樣性。

接著為您介紹一下晶諾生物NTM測序的質控及分析平臺：

 

一、質控平臺

為了從源頭上保證測序數據的準確性、可靠性，對樣品提取、DNA檢測、建庫、測序每一個生產步驟都嚴格把控，從源頭上確保了高質量數據的產出。

1、DNA提?。?/strong>

基因組提取我們采用改良版的CTAB法，由經驗豐富的專業人員處理，以保證DNA的高質量。

2、建庫前質控：

使用Qubit熒光光度計、瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 5400對DNA的純度、完整性及濃度進行精確檢測，樣本合格后建庫。

3、文庫及測序數據質控：
文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測，插入片段大小符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量分析，多個環節并重以保證文庫質量。文庫檢測合格后，按照有效濃度及目標下機數據量的需求將不同文庫pooling至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina高通量測序平臺NovaSeq 6000進行測序，原始數據量產出1G以上。

 

二、NTM分析內容

1、非結核分枝桿菌物種鑒定（流程如下）

 

物種鑒定結果示例：

以95%的相似度為閾值進行分枝桿菌物種判定，同時也可分析出相應的亞種。

 

2、系統進化樹

NTM樣本系統進化樹示例：

根據相似度矩陣構建系統發育樹，分析種間及種內群體多樣性。

NTM常規分析結果交付內容：測序原始數據、拼接數據、NTM鑒定結果（excel)、系統進化樹。

 

3、高級分析*

（1）分枝桿菌毒力基因分析：通過同源性比對分析分枝桿菌毒力相關基因在測序菌株中的情況，并進行聚類分析。

（2）細胞壁重要脂質成分合成基因簇分析：細胞壁脂質是分枝桿菌致病性的重要因子，根據相關合成基因的分布情況，評估測序菌株細胞壁脂質情況。

除以上分析，我們還可以提供對菌種鑒定后的突變信息分析，可分析出對比參考基因組的基因突變情況，導出基因突變信息（SNP、插入缺失小片段）。

*基礎分析不包含高級分析

 

歡迎感興趣的老師前來咨詢哦！

 

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