結(jié)核分枝桿菌全基因組測(cè)序

文庫制備方法、測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)發(fā)展迅速，且成本逐漸減低，為二代測(cè)序應(yīng)用于病原菌感染性疾病診斷和分子流行病學(xué)分析帶來了革命性的進(jìn)展。

隨著測(cè)序技術(shù)的日益成熟和生物信息學(xué)的發(fā)展，全基因組測(cè)序和分析已被廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的分子檢測(cè)（早期輔助診斷）、抗結(jié)核藥物敏感性的預(yù)測(cè)（指導(dǎo)臨床用藥和制定科學(xué)的治療方案），以及對(duì)地區(qū)傳播模式的分子流行病學(xué)研究（有助于發(fā)現(xiàn)和控制疫情）中，為解決結(jié)核病的早期診斷和耐藥問題，以及有效控制疫情傳播提供了很大的幫助。

晶諾專業(yè)致力于結(jié)核病相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的基因組特征，建立了針對(duì)性、標(biāo)準(zhǔn)化的基因組提取和質(zhì)控評(píng)估平臺(tái)，已有幾萬株結(jié)核分枝桿菌基因組數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析經(jīng)驗(yàn)。

下面詳細(xì)介紹一下晶諾的結(jié)核測(cè)序、分析平臺(tái)：

一、質(zhì)控評(píng)估平臺(tái)

為了從源頭上保證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性，對(duì)樣品提取、DNA檢測(cè)、建庫、測(cè)序每一個(gè)生產(chǎn)步驟都嚴(yán)格把控，從源頭上確保了高質(zhì)量數(shù)據(jù)的產(chǎn)出。

（1）DNA提取：

基因組提取我們采用改良版的CTAB法，由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員處理，以保證DNA的高質(zhì)量。

（2）建庫前質(zhì)控：

濃度檢測(cè)：Qubit熒光光度計(jì)

完整性檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳

根據(jù)濃度、體積、總量、電泳結(jié)果來綜合評(píng)判樣本質(zhì)量。

（3）文庫及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控：
文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，插入片段大小符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，多個(gè)環(huán)節(jié)并重以保證文庫質(zhì)量。文庫檢測(cè)合格后，按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求將不同文庫pooling至flowcell，cBOT成簇后使用illumina高通量測(cè)序平臺(tái)NovaSeq 6000進(jìn)行測(cè)序，原始數(shù)據(jù)量產(chǎn)出1G以上，測(cè)序平均深度可達(dá)200X以上。

二、結(jié)核菌全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析平臺(tái)

（1）耐藥分析

基因型預(yù)測(cè)是基于異煙肼（ahpC、inhA、fabG1和katG）、利福平（rpoB）、乙胺丁醇（embA、embB和embC）和吡嗪酰胺（pncA）等耐藥性相關(guān)基因內(nèi)或上游的突變。根據(jù)已知的結(jié)核耐藥突變數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)常用抗結(jié)核藥物（異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、鏈霉素、氟喹諾酮、氨基糖苷類、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫異煙胺、對(duì)氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、利奈唑胺、貝達(dá)喹啉、氯法齊明、迪拉馬尼）的敏感性，全基因組測(cè)序涵蓋的基因組位點(diǎn)數(shù)量幾乎不受限制，但可能無法檢測(cè)到具有復(fù)雜基礎(chǔ)基因相互作用的耐藥機(jī)制。

耐藥分析示例：

圖1

圖2

圖1給出了樣本菌株的譜系、敏感、耐多藥或廣泛耐藥，以及對(duì)應(yīng)藥物耐藥的突變點(diǎn)信息，其中-為未發(fā)現(xiàn)已知對(duì)應(yīng)的藥物耐藥基因型。圖2為耐藥基因的突變頻率，突變點(diǎn)在樣本中可能有些菌株突變、有些未突變。

注：lineage1為環(huán)印度洋分枝、lineage2為東亞分枝（北京系）、lineage3為中亞東非印度分枝、lineage4為歐美分枝、lineage5和lineage6為主要流行于西非的非洲分枝，M. africanum West Africa 1 和 M. africanum West Africa 2、Lineage7 埃塞俄比亞分枝。

（2）遺傳距離分析——近期傳播關(guān)系

傳統(tǒng)分子流行病學(xué)方法一般使用IS6110 RFLP、spoligotype、VNTR等基因分型方法鑒定結(jié)核病傳播鏈，但使用全基因組測(cè)序的方法相較于基因分型具有更多的優(yōu)勢(shì)，如全基因組測(cè)序具有更高的分辨率，全基因組測(cè)序是基于基因組間的SNP差異數(shù)來確定兩兩菌株間是否具有近期傳播關(guān)系，而傳統(tǒng)基因分型只是基于部分基因進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果可能造成基因型相同的菌株存在不同的傳播源和傳播路徑。另一方面，傳統(tǒng)基因分型很難準(zhǔn)確鑒別傳播發(fā)生的路徑、順序及是否存在多個(gè)傳播源，而通過全基因組數(shù)據(jù)分析可解決此類問題。

遺傳距離分析示例：

該圖為每?jī)蓚€(gè)菌株間的SNP差異數(shù)矩陣，一般認(rèn)為SNP<12個(gè)，兩菌株間具有近期傳播關(guān)系，可結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查鑒定地區(qū)結(jié)核病的傳播鏈。

此項(xiàng)分析在流行病學(xué)調(diào)查研究中更具有明顯優(yōu)勢(shì)，隨著高通量測(cè)序的普遍應(yīng)用及成本優(yōu)勢(shì)，有望取代傳統(tǒng)的基因分型方法，成為分子流行病學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)。

除了以上常規(guī)分析內(nèi)容，晶諾新增個(gè)性化分析內(nèi)容——構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并將以上的數(shù)據(jù)內(nèi)容進(jìn)行匯總圖形化顯示，更清晰區(qū)分各菌株間關(guān)系、藥物的敏感性、譜系及耐藥分類。

系統(tǒng)進(jìn)化樹示例：

圖中線長(zhǎng)短用于表示兩個(gè)菌株間的遺傳距離，譜系、耐藥分類使用顏色進(jìn)行了區(qū)分，藥物敏感性使用了空實(shí)圈進(jìn)行標(biāo)注，黑色圓圈表示耐受對(duì)應(yīng)藥物，白色圓圈表示對(duì)應(yīng)藥物敏感。

除此之外，也可定制其它高級(jí)分析內(nèi)容，歡迎咨詢！

 

分枝桿菌基因組提取樣品制備方法

一．樣品培養(yǎng)

1.固體培養(yǎng)

吸取一定體積的菌液（根據(jù)菌體濃度調(diào)整吸取體積）至固體培養(yǎng)基劃線（單線法、四區(qū)法均可），錫箔紙包裹，37°C倒置培養(yǎng)，直至克隆直徑為0.5-1 cm大小。

2.液體培養(yǎng)

挑取單克隆或吸取一定體積的菌液（根據(jù)菌體濃度調(diào)整吸取體積）至液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基體積不超過容器總體積的1/5或特殊容器規(guī)定的最大培養(yǎng)體積。37°C靜置培養(yǎng)，直至菌液濃度達(dá)到OD600=0.8-1。

 

二. 樣品滅活

1.菌落處理方法

挑取黃豆粒大小的菌落至TE溶液（25 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA）中，盡量避免挑取任何固體培養(yǎng)基（混有培養(yǎng)基會(huì)影響后續(xù)基因組提取效果），TE溶液體積需淹沒菌落。金屬浴80℃加熱30分鐘。滅活后的樣品立即取出并凍存于-80℃冰箱。寄送前請(qǐng)勿反復(fù)凍融。

2.菌液處理方法

吸取1mL濃度達(dá)到OD600=0.8-1新鮮菌液至螺紋管中，13000 rpm離心10分鐘。棄掉上清，加入500 μL的TE溶液（25 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA）。金屬浴80℃加熱30分鐘。滅活后的樣品立即取出并凍存于-80℃冰箱。寄送前請(qǐng)勿反復(fù)凍融。

菌株分類	序號(hào)	菌株名稱	滅活條件
細(xì)菌	1	沙門氏菌	80℃水浴15min
	2	志賀氏菌	70℃水浴15min
	3	單核細(xì)胞增生李斯特氏菌	80℃水浴15min
	4	副溶血性弧菌	60℃水浴30min
	5	結(jié)核分枝桿菌	80℃水浴30min
	6	唐菖蒲伯克霍爾德	80℃水浴30min
	7	肺炎鏈球菌	60℃水浴30min
	8	流感嗜血桿菌	60℃水浴30min
	9	霍亂弧菌	60℃水浴30min
	10	創(chuàng)傷弧菌	60℃水浴30min
	11	非結(jié)核分枝桿菌	80℃水浴30min
	12	大腸埃希氏菌	70℃水浴15min
	13	鮑曼不動(dòng)桿菌	80℃水浴30min
	14	幽門螺桿菌	80℃水浴30min
	15	肺炎克雷伯菌	60℃水浴30min
	16	支原體	60℃水浴30min
	17	銅綠假單胞菌	60℃水浴60min
	18	沙門氏菌	80℃水浴15min
	19	金黃色葡萄球菌	80℃水浴30min
	20	化膿鏈球菌	60℃水浴30min
真菌	1	白假絲酵母菌(白色念珠菌)	60℃水浴60min
	2	馬爾尼菲籃狀菌	60℃水浴60min
	3	新生隱球菌	60℃水浴10min

以上均為最佳滅活條件，如溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)，或沒有加TE buffer，則可能影響提取效果。

請(qǐng)勿將干菌體直接進(jìn)行滅活，根據(jù)晶諾實(shí)驗(yàn)室的操作標(biāo)準(zhǔn)流程，干滅的樣本會(huì)被認(rèn)為仍然存在風(fēng)險(xiǎn)，如仍需繼續(xù)項(xiàng)目，我們將啟動(dòng)生物安全實(shí)驗(yàn)室流程并產(chǎn)生費(fèi)用，請(qǐng)注意！

 

如需TE Buffer，我們有100 mL和500 mL規(guī)格的產(chǎn)品，請(qǐng)與我們聯(lián)系。

產(chǎn)品名稱：TE緩沖液

產(chǎn)品貨號(hào)：60340K

 

三．樣品運(yùn)輸

樣品在運(yùn)輸途中避免溫度的變化而出現(xiàn)DNA降解，推薦10-15kg干冰運(yùn)輸。

【溫馨小提示】

*凍存盒可用皮筋或膠帶纏好，如盒內(nèi)有空隙可用干凈的紙?zhí)畛洌苊膺\(yùn)輸過程中樣本晃動(dòng)使蓋子打開。

*如用自封袋，請(qǐng)保證袋子不易破損和袋口密封，避免樣本掉落。可再套一兩個(gè)袋子。

*請(qǐng)勿直接將樣本管置于干冰中。

 

測(cè)序樣本命名標(biāo)準(zhǔn)

1、樣本編號(hào)只能由阿拉伯?dāng)?shù)字、字母、- 組成。例如A001-1是可以識(shí)別的編號(hào)。

2、不要用數(shù)字0作為開頭。

3、樣本編號(hào)不能包含中文、空格、/\ . : * ? ” < > | ① ②……等特殊字符，如有，分析時(shí)我們會(huì)用拼音替換中文，數(shù)字替換特殊字符。

 

 

分享一些有關(guān)結(jié)核分枝桿菌全基因組測(cè)序分方面的綜述文章，希望能對(duì)結(jié)核基因組測(cè)序感興趣的您有所幫助。

 

文獻(xiàn)分享：

1、張潔,任怡宣,潘麗萍,張宗德.全基因組測(cè)序在結(jié)核分枝桿菌研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)防癆雜志，2020年7月第42卷第7期.

鏈接：http://www.zgflzz.cn/CN/10.3969/j.issn.1000-6621.2020.07.017

2、徐鵬,甘明宇,高謙.二代測(cè)序技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].微生物與感染，2015年2月25日，10（1）：54-60.

鏈接：http://jmi.fudan.edu.cn/CN/abstract/abstract491.shtml